Éthique
Tous les protocoles de soins animaliers ainsi que les protocoles expérimentaux utilisés dans cette étude ont été réalisés conformément aux lignes directrices et réglementations fournies par le Comité d’éthique institutionnel du Royan Institute. De plus, le manuscrit respecte les recommandations des directives ARRIVE. Nous soulignons également qu’aucun essai impliquant des humains ou l’utilisation d’échantillons de tissus humains n’a été mené dans cette étude.
Médias et réactifs
Tous les milieux et produits chimiques ont été préparés à partir de Gibco (Grand Island, NY) et de Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO).
Conception expérimentale
Cette étude a comporté deux expériences. La première a consisté à récupérer des ovocytes provenant des ovaires de bovins abattus et à les répartir en quatre groupes expérimentaux selon la supplémentation soit du milieu de maturation in vitro (IVM) soit du milieu de culture in vitro (IVC). La seconde expérience a impliqué des ovocytes collectés par ponction ovarienne après stimulation à l’FSH, en se concentrant exclusivement sur le groupe le plus performant de la première expérience, à savoir Sup-IVM/IVC, ainsi qu’un groupe témoin. Les embryons issus de cette expérience ont été transférés à des récipiendaires pour évaluer leur compétence de développement post-implantation.
Design de l’Expérience 1
Dans cette première expérience (voir Figure 2A), des complexes cumulus-ovocytes bovins (COCs) ont été aspirés des ovaires de vaches Holstein et soumis à une maturation in vitro suivie par une culture in vitro. Les ovocytes collectés ont été répartis aléatoirement en 4 groupes correspondant à différentes interventions : (1) IVM/IVC, c’est-à-dire mature in vitro puis cultivé dans un milieu standard sans supplémentation ; (2) Sup-IVM/IVC, supplémenté durant IVM mais pas durant IVC ; (3) IVM/Sup-IVC, supplémenté uniquement durant IVC ; et (4) Sup-IVM/Sup-IVC, supplémenté à la fois durant IVM et IVC. Les substrats et co-facteurs OCM ont été supplémentés de la manière suivante : Betaine (213,4 µM), Cystine (58,26 µM), Zinc bisglycinate (10 µM), Nicotinamide/B3 (16,37 µM), Pyridoxine/B6 (10 µM), Riboflavin/B2 (26,6 µM), 5-méthyltétrahydrofolate (5mTHF, 1 µM) et Methylcobalamin/B12 (1 µM). Les taux de clivage et de blastocystes ont été évalués respectivement 3 et 8 jours après fécondation.
Maturation in vitro des ovocytes
Les COCs ont été aspirés de follicules de 2 à 8 mm issus d’ovaires de bovins abattus par une aiguille de calibre 18 attachée à une pompe à vide (pression de 80 mm Hg). Le milieu d’aspiration était composé de TCM-199 tamponné au HEPES, supplémenté de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et d’héparine (10 UI/mL). Les COCs avec une zone pellucide et une membrane cytoplasmique intactes, un cytoplasme homogène et au moins 3 couches de cellules cumulus compactes ont été sélectionnés et transférés dans un milieu de maturation.
Les COCs sélectionnés ont été incubés pendant 24 heures dans un milieu de maturation composé de TCM supplémenté de 10 % de FBS, 1 µg/mL d’estradiol-17β, 2,5 mM de pyruvate de sodium, 10 µg/mL d’hormone folliculo-stimulante (FSH), 10 µg/mL d’hormone lutéinisante (LH), 0,1 mM de cystéamine, 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique et 10 µg/mL de facteur de croissance insulinique (IGF, R&D, USA) à 38,5 °C, 6 % de CO2 et une humidité maximale.
Fécondation in vitro (FIV) et culture in vitro (CIV)
La fécondation in vitro a été réalisée comme précédemment décrit. En résumé, après décongélation du sperme, les spermatozoïdes mobiles ont été sélectionnés par la méthode de descente en nageant avec un gradient PureSperm. Les COCs matures ont ensuite été co-incubés avec 10⁶ spermatozoïdes/mL dans 50 µL de milieu de fécondation pendant 18 à 20 heures dans une atmosphère humide à 5 % de CO2 et 38,5 °C.
Environ 20 heures après fécondation, les zygotes présomptifs ont été mécaniquement débarrassés des cellules cumulus à l’aide d’une pipette. Un fluide oviducte synthétique modifié (mSOF), soit un SOF supplémenté avec myo-inositol (3 mM) et ITS (insuline 5 µg/mL, transferrine 5 µg/mL et sélénium 5 ng/mL), a été utilisé pour la culture des embryons. Au cours des trois premiers jours, les zygotes mis en culture étaient maintenus dans du mSOF sans glucose ni sérum (mSOF⁻) à 38,5 °C, 5 % d’O2, 6 % de CO2 et dans un air humidifié sous de l’huile minérale. Le jour 3 après culture, les embryons étaient transférés dans un milieu SOF supplémenté de 5 % de sérum et 1,5 mM de glucose (mSOF⁺). Les taux de clivage et de blastocystes ont été évalués respectivement aux jours 3 et 8 après fécondation.
Expérience 2
Design de l’Expérience 2
Dans la seconde enquête, des ovocytes GV récupérés par ponction ovarienne chez des génisses Holstein ont été répartis aléatoirement entre IVM avec ou sans la même supplémentation OCM, suivie d’une FIV et d’une CIV dans un milieu conventionnel jusqu’au jour 7. Les blastocystes de meilleure qualité des deux groupes ont ensuite été utilisés pour un transfert d’embryons unique chez des bovins récipiendaires. Le taux de grossesse en cours a été évalué aux jours 35, 90 et 180 de la gestation, et le nombre final de veaux vivants et morts a été enregistré.
Notre point de vue
Il est crucial de reconnaître l’importance des nouvelles avancées en matière de reproduction animale et d’éthique qui en découlent. En intégrant la science moderne avec les responsabilités éthiques, nous avons le potentiel de transformer notre rapport aux animaux, notamment dans le domaine de la production alimentaire. Une approche responsable pourrait également ouvrir des voies vers des pratiques durables et respectueuses de l’environnement. Si nous réussissons à marier l’innovation scientifique et le respect des normes éthiques, nous pourrions non seulement améliorer la qualité de vie des animaux de ferme, mais aussi assurer une avenir plus sain pour notre planète.
